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牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）說明書

【產品名稱】

通用名稱：牛傳染性胸膜肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）

英文名稱：Contagious Bovine Pleuropneumonia (CBPP)Detecting Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規格】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【預期用途】

本試劑盒利用改良分子信標實時熒光PCR原理，主要用于牛傳染性胸膜肺炎的定性篩查檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒針對牛傳染性胸膜肺炎基因設計特異性引物和探針，在反應體系中含有牛傳染性胸膜肺炎 DNA模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為不含牛傳染性胸膜肺炎核酸的其它菌的混合物，陽性對照為牛傳染性胸膜肺炎經滅活處理的核酸提取物。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 動物組織樣本采集后取10mg～100mg用滅菌生理鹽500μL～1000μL水研磨，離心后取上懸液備用，避免標本間交叉污染。

2. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結果，但有可能影響培養法檢測結果的準確性。

3. 標本保存期間應避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑準備（試劑準備區）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數

(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

(4) 蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管和試劑盒中的DNA提取液轉移至樣本處理區。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。

2.樣本準備（樣本處理區）

用本公司病毒核酸提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。或按以下方法操作：

a.取試劑準備區傳遞過來的DNA提取液，2000 rpm 離心10 s后備用。

b.取樣本自然沉降后的上清液1 mL，加入到1.5 mL無菌離心管中，12000 rpm離心5 min后，吸干上清，保留沉淀。

c.每管沉淀中加入DNA提取液50 μL，將沉淀懸浮后100℃加熱處理5 min。

d.12000 rpm離心2 min，取上清用于PCR檢測。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【陽性判斷值或者參考區間】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性】

• 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的低檢出*可能會發生假陰性的結果。
• 本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結果應進一步使用培養法進行確診。

【產品性能指標】 產品的低檢出限為10²CFU，產品CV值≤5%。

【注意事項】

• 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進行操作，各區實驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區應該配有紫外線殺菌裝置。
• 每次實驗應該設置陰、陽性對照。
• 為保證試劑不受標本污染，必須將DNA提取液、混合酶液及PCR反應液保存于試劑準備區。
• 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心。
• 試劑盒內所配陰性和陽性對照在di一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
• 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記。
• 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用。
• ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
• 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。
• 喹諾酮類快速檢測試劑盒